Estudio de la α-amilasa recombinante AmiJ33r y del gen que la codifica

Abstract

En el presente trabajo el gen que codifica para la α-amilasa AmiJ33, de Bacillus amyloliquefaciens JJC33M, se aisló, clonó y expresó heterólogamente en Escherichia coli. El análisis in sílico de la secuencia peptídica de AmiJ33r predijo una proteína de 659 aminoácidos con un peso molecular de 72kDa (22kDa más que AmiJ33 nativa) y mostró una estrecha relación filogenética con α-amilasas de B. amyloliquefaciens sp., plantarum. En comparación con otras enzimas recombinantes AmiJ33r fue exportada al medio extracelular y mostró características bioquímicas distintas a AmiJ33 nativa. AmiJ33r sólo fue capaz de hidrolizar almidón gelatinizado, mientras que AmiJ33 hidroliza tanto almidón nativo como gelatinizado. Se requirió una mayor concentración de (NH4)2SO4 para precipitar AmiJ33r (80%), en comparación con el 60% usado para precipitar AmiJ33 debido a que la región extra del C-terminal es rica en aminoácidos hidrofílicos. Con respecto al efecto del pH en la actividad, AmiJ33r mostró un perfil de actividad distinto al de AmiJ33. AmiJ33r presentó un pH óptimo a 9, mientras que AmiJ33 tiene un pH óptimo a 5. En cuanto a la estabilidad de la actividad con respecto al pH, AmiJ33r mostró su máxima actividad a pH 5 y 7 y mostró ser menos estable que AmiJ33 a pHs ligeramente ácidos (pH 4). Al evaluar el efecto de temperatura en la actividad AmiJ33r mostró un perfil parecido al de AmiJ33, presentando una temperatura óptima a 80°C. Asimismo, AmiJ33r presentó un perfil de termoestabilidad similar a AmiJ33, mostrando una vida media de 23h, 4.4h y 17.4min a 40, 50 y 60ºC respectivamente. La actividad de AmiJ33r se incrementó 22% con Mn2+ (5mM) y 18% con Ca2+ (10mM). Sorprendentemente AmiJ33r mostró el 60% de actividad en presencia de SDS al 1% (v/v) mientras que, en las mismas condiciones, la actividad de AmiJ33 se inhibió. La actividad de ambas enzimas se inhibió en presencia de 1% (v/v) de β-mercaptoetanol. La evidencia sugiere que los aminoácidos de la región extra del C-terminal de AmiJ33r promueven que la enzima presente mayor actividad a pHs alcalinos y eliminan la capacidad de AmiJ33r para hidrolizar almidón nativo.