Diseño in silico y construcción in vitro de plásmidos binarios para el análisis funcional del gen SUB1A-1

Abstract

La inundación es uno de los problemas más graves que enfrentan los cultivos agrícolas y silvestres en gran parte del territorio mexicano. Desde la aparición de las plantas en la tierra, éstas han desarrollado mecanismos moleculares para la defensa y la respuesta al estrés ambiental mediante la regulación de su expresión génica y el ajuste de los cambios metabólicos necesarios para la obtención de energía de las reservas de carbohidratos. En el caso del estrés por inundación, el etileno activa a los factores de transcripción llamados Ethylene Response Factors (ERFs) entre los que está el gen SUB1A1, uno de los principales determinantes genéticos de la tolerancia a la inundación. En el arroz, el gen SUB1A-1 está bajo el control de su promotor nativo y confiere tolerancia a la inundación. Cuando se expresó de forma heteróloga a SUB1A-1 en Arabidopsis bajo el control del promotor fuerte 35S, el resultado fue un fenotipo no tolerante a la inundación, probablemente por la inhibición permanente en el uso de almidón. De esta forma, surge la necesidad de expresar a SUB1A-1 de forma inducible para poder transferir esta capacidad de tolerancia a otras especies vegetales. En el presente trabajo se emplearon herramientas de la biología molecular, como las enzimas de restricción, la simulación in silico, la PCR, la electroforesis, la ligación y la transformación de bacterias para la clonación del gen SUB1A-1 en diferentes tipos de vectores, para lograr construir un casete de expresión que permita en el futuro, transformar e inducir la expresión de SUB1A-1 bajo el estímulo del etanol a través del sistema de expresión fúngico AlcR-pAlcA. Para lograr lo anterior, se planteó una estrategia experimental que partió desde la extracción de ADN genómico de plantas de Arabidopsis previamente transformadas con SUB1A-1 pero bajo el control del promotor 35S, hasta la verificación por secuenciación del casete de expresión 35S:AlcR::pAlcA:SUB1A-1-3xFLAG..