Establecimiento de cultivos de raíces transformadas de Stevia rebaudiana Bertoni mediada por Agrobacterium rhizogenes ATCC15834

Abstract

Stevia rebaudiana es una planta de gran importancia por sus metabolitos secundarios, los cuales poseen actividades biológicas con aplicaciones en la industria farmacéutica y alimentaria. La obtención de dichos metabolitos mediante técnicas de cultivo clásico es una limitante debido a la germinación escasa de las semillas y la dificultad de obtener plantas completas, lo que conlleva a bajos rendimientos de los compuestos. Por ello se han implementado estrategias, tales como el cultivo in vitro y la transformación genética para su producción a partir de cultivos transformados, principalmente raíces pilosas gracias a las ventajas que ofrecen de alta productividad, facilidad de cultivo y estabilidad genética. El objetivo de este trabajo fue establecer cultivos de raíces transformadas de S. rebaudiana mediante un protocolo eficiente de transformación con la cepa silvestre ATCC15834 de Agrobacterium rhizogenes. La inducción de raíces se realizó mediante infección de explantes meristemáticos obtenidos de plántulas in vitro, en co-cultivo con la bacteria en suspensión por 24 h y 48 h. Las primeras raíces pilosas aparecieron a los 7 días de la infección, después de esto las observaciones se registraron a los 14 y 21 días. Las raíces emergidas se propagaron individualmente en medio MS (Murashige y Skoog) libre de reguladores de crecimiento y se seleccionaron por tamaño y fenotipo. La eficiencia máxima de inducción fue de 88.89 ± 7.50 % y el mayor número de raíces por explante fue de 2.44 ± 0.35, ambos obtenidos después de 21 días de inducción con co-cultivos de 24 h. De un total de 16 raíces seleccionadas, sólo 4 raíces (R09, R12, R13 y R14) desarrollaron el fenotipo característico de raíces pilosas después de 30 días de cultivo individual, cuya transformación se confirmó por amplificación de un fragmento de 150 pb del gen rol B por PCR. Los cultivos fueron evaluados mediante una cinética de crecimiento en medio MS líquido durante 21 días. La acumulación de biomasa máxima se observó en la línea transformada R12 con 7.52 ± 0.49 g de peso fresco a los 21 días de cultivo, y de acuerdo al análisis de índice de crecimiento tuvo un aumento de 5.83 ± 0.44 veces en peso fresco. Las 4 líneas transformadas tuvieron un mayor crecimiento comparadas con el cultivo control de raíces no transformadas. Los resultados obtenidos muestran el establecimiento de 4 cultivos de raíces transformadas de S. rebaudiana mediante un protocolo de transformación eficiente y además, señalan que el tiempo de co-cultivo y el período de inducción son factores que influyen significativamente en el proceso de agrotransformación