Elaboración de un protocolo para construir bibliotecas de RNAs pequeños y su implementación para el estudio de la respuesta a sequía crónica en Brachypodium distachyon L

Abstract

Los microRNAs son moléculas de RNA de longitud corta que desempeñan funciones importantes durante el desarrollo y en la respuesta a los estímulos ambientales. Por su relevancia, el estudio de los microRNAs ha experimentado grandes avances en los últimos años. Uno de los pasos esenciales para el estudio de los microRNAs es su secuenciación, para lo cual existen protocolos que permiten la construcción de bibliotecas de RNAs pequeños que pueden secuenciarse masivamente por síntesis. Basado en el fundamento de protocolos tradicionales de construcción de bibliotecas, en este trabajo de tesis se realizaron modificaciones para proponer un protocolo in house. Como resultado, se observó que los parámetros que impactan la calidad de las secuencias son la adición de un agente aglomerante de baja viscosidad, la optimización de las concentraciones de los adaptadores y el empleo de RNA previamente purificado para seleccionar RNAs de 20-30 nt. Adicionalmente, se propuso el empleo del oligonucleótido BRIDGE para reducir los costos de adquisición de adaptadores de RNA preadenilados. Con el protocolo se logró reducir el tiempo de preparación de las bibliotecas y el número de pasos de manipulación del RNA. Además, se redujo la presencia de productos secundarios no deseados y disminuyeron los costos de producción.