Aislamiento y caracterización de mutantes de T-DNA en genes que codifican para factores de transcripción activos durante el estrés por inundación en Brachypodium distachyon

Abstract

Directora de Tesis: Dra. Blanca Estela Barrera Figueroa Co-Director de Tesis: Dr. Edgar Baldemar Sepúlveda García

Los factores de transcripción (FT) son proteínas que regulan la expresión de genes y procesos durante el desarrollo de las plantas. En el estrés por inundación, se han encontrado FTs de las familias ETHYLENE RESPONSE FACTOR (ERFs), WRKYs, NO APICAL MERISTEM (NAM), ZINC FINGER (ZF), HEAT SHOCK FACTORS (HSFs) y AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF). Recientemente, el Departamento de Energía de Estados Unidos liberó una colección de líneas de T-DNA de Brachypodium distachyon que son útiles para conocer la función de los genes interrumpidos. En este trabajo, se propone estudiar a mutantes de T-DNA en genes que codifican FTs activos durante el estrés por inundación. A partir de la base de datos de secuenciación del transcriptoma (RNA-Seq) de B. distachyon Bd21 inundado por 48 h (GSE74222) generada en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la UNPA, se seleccionaron los FTs activos durante la inundación. Posteriormente, se realizó la búsqueda de las líneas con inserción de T-DNA de Brachypodium en la base de datos JGI-DOE y se solicitaron las semillas. Se realizaron análisis bioinformáticos para diseñar oligonucleótidos y seguir la segregación genética de la inserción. Una vez encontrados mutantes homocigotas, se verificó la inserción de T-DNA mediante PCR. Posteriormente, las plantas identificadas como mutantes insercionales, se crecieron y caracterizaron fenotípicamente en condiciones de crecimiento normal y estrés por inundación. Se midió el tiempo de floración, morfología en general, tiempo letal 50 (LT50), número de hojas y porcentaje de supervivencia. El fondo genético de Brachypodium donde se enuentran las mutantes de T-DNA es Bd21-3, la tolerancia al estrés por inundación en dicho ecotipo no ha sido evaluada, por lo que se probó y se clasificó como un ecotipo tolerante a dicho estrés y se usó para comparar el desempeño de las mutantes. Las mutantes presentaron un decremento en la integridad menor que el de las plantas silvestres, pero no logró diferenciarse estadísticamente. Sin embargo, sí se observó que las mutantes para los genes Bradi2g54720 (JJ20483-T3W-5, BdWRKY57), Bradi2g22440 (JJ19596-T96W-7, BdWRKY46) y Bradi1g17961(JJ28379-T9E-3 y JJ22103 T3E-1, ERFs-VII) presentaron un fenotipo de acamamiento lo que indica que estos FTs están involucrados en la represión del ablandamiento de la pared celular característico de las plantas que se elongan durante el estrés por inundación.