Identificación de Brucella abortus mediante la técnica de qPCR y el análisis HRM

Abstract

Brucella abortus es una bacteria patógena gram negativa que afecta directamente al ganado bovino desde el punto de vista reproductivo y productivo, causando pérdidas económicas en el sector ganadero. La identificación de enfermedades, en específico las generadas por las especies del género Brucella sigue siendo un gran desafío por el alto grado de homología que comparten todas ellas en sus genomas. De tal manera, con el objetivo de generar un método de diagnóstico molecular capaz de identificar la especie abortus del género Brucella se planteó utilizar técnicas moleculares como la qPCR en conjunto con el análisis HRM, así como la secuenciación de las muestras positivas para verificar los resultados. En este estudio se utilizaron 82 muestras de sangre de ganado bovino como probables sospechosos de infección por Brucella abortus. Como control positivo se empleó ADN de la cepa vacunal RB51, como control negativo se usó ADN de Bacillus thuringiensis y la mezcla de reacción sin ADN. Mediante qPCR se amplificó un fragmento del gen GLK, un gen conservado para dicha especie. Se amplificaron 45 muestras de ADN bovino de las cuales, se eligieron 10 muestras al azar, incluyendo al control positivo, para estudiar los posibles cambios de base se empleó el análisis HRM con un aumento de temperatura de 0.3°C dentro de un rango de 60°C a 95°C utilizando como agente intercalante a SYBR Green, con un aumento de temperatura de 0.3°C dentro de un intervalo de 60°C a 95°C. Los productos de PCR fueron secuenciados para verificar si el segmento amplificado correspondía al esperado. Se identificó la especie Brucella abortus en 8 de las 10 muestras, así mismo los primers permitieron identificar a Brucella melitensis en una de estas, pudiendo ser diferenciadas mediante el análisis HRM debido al patrón de curvas melting de cada especie identificada, dichos resultados fueron corroborados mediante secuenciación. La secuenciación permitió determinar que el número de cambios de base encontrados en una secuencia es proporcional al cambio en su curva de disociación, es decir entre más cambios de base se observan mayor será la diferencia en la curva de disociación con respecto al control y por ende una mayor probabilidad de que se trate de una especie o cepa diferente. En conjunto los resultados demuestran que la metodología propuesta en este trabajo puede ser utilizada para la identificación especifica de Brucella abortus y distinguir entre cepas o especies