Estudio del efecto de la proteinasa K sobre la disociación de la proteína Cry1Ac en Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-73

Abstract

Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) es una bacteria cosmopolita que pertenece a un conjunto de microorganismos llamado “Grupo de Bacillus cereus”. B. thuringiensis se diferencia de los integrantes de este grupo por tener la capacidad de sintetizar un cristal insoluble de naturaleza proteica. Esta proteína caracteriza a B. thuringiensis como un entomopatógeno de alto interés agronómico, ya que es el principio activo de formulaciones bioinsecticidas contra larvas de insectos de diversos órdenes. Así mismo, se han aislado genes de Bacillus thuringiensis para la producción de plantas transgénicas con la capacidad de producir dicha proteína. Por otro lado, a inicios del año 2000 se reportó que los cristales insolubles son proteínas con actividad citotóxica hacia células de cáncer. Para que los cristales proteicos presenten actividad insecticida o anticancerígena in vitro deben ser disociados e hidrolizados. Es decir, separar las proteínas que forman el cristal proteico y generar las protoxinas in vitro mediante el uso de agentes reductores y un medio alcalino. Posteriormente, se hidrolizan las cadenas polipeptídicas con endopeptidasas del tipo de tripsina o quimotripsina para producir polipéptidos tóxicos. La formación de los cristales en B. thuringiensis ocurre durante la fase de esporulación junto con la formación de la espora, y se han reportado como procesos dependientes en algunas cepas de B. thuringiensis. En un estudio previo se midió la expresión de genes (nprR-nprX, nprA) relacionados a la comunicación célula-célula y a la regulación de la esporulación, para lo cual se empleó la proteinasa K (PK) para interrumpir la señal que inician los péptidos NprR-NprX que desencadenan la comunicación celular. Se observó que, aunque hubo expresión del gen cry no hubo presencia de las proteínas insolubles en el medio al final de la fermentación. Esto parece indicar que la adición de PK al medio durante la fermentación de B. thuringiensis var. kurstaki HD73 disoció el cristal. Por lo tanto, en el presente trabajo se buscó determinar la posible disociación in vitro de los cristales de proteína Cry de B. thuringiensis var. kurstaki HD-73, que tiene la capacidad de producir un solo cristal (k-73). Además, se adicionó PK a cultivos en medio liquido de B. thuringiensis var. kurstaki HD-73 durante las etapas de crecimiento exponencial y de esporulación para verificar si la PK impedía la formación o disociaba el cristal presente en el medio. La detección de la proteína Cry se realizó con geles SDS-PAGE al 7%. Se observó que la PK no tuvo efecto de disociación, sin embargo; se sugiere que la adición de la PK en una fermentación de B. thuringiensis var. kurstaki HD-73 produce alteraciones en funciones intracelulares que no permiten la formación del cristal K-73. Por otro lado, al adicionar la PK después de disociar el cristal con agentes reductores a altos valores de pH, se observó la presencia de toxinas Cry de aproximada 60 kDa y varias fracciones peptídicas de menor tamaño. Utilizando una concentración de 100 nM de PK después de disociar el cristal se observaron fracciones polipeptídicas menores a 48 kDa.