Establecimiento de cultivos de raíces transformadas de Stevia rebaudiana con el plásmido binario pCAMBIA1105.1 y diseño de una estrategia de ingeniería metabólica para la modificación de la ruta de biosíntesis de glucósidos de esteviol

Abstract

Stevia rebaudiana es una planta herbácea de importancia terapéutica, comúnmente empleada como fuente de edulcorantes y principalmente con propiedades anticancerígenas y antihipertensivas. Los Glucósidos de Esteviol (GEs) son producidos en S. rebaudiana a partir de la ruta 2-C-metil-D-eritritol-4 fosfato (MEP) usando bloques de isoprenoides como precursores. La vía MEP se lleva a cabo en el cloroplasto y actualmente se desconoce gran parte de su regulación y los mecanismos que dirigen los flujos metabólicos en puntos convergentes de rutas biosintéticas; uno de los puntos esenciales de regulación es el catalizado por la enzima Isopentenil pirofostafo isomerasa 1 (IPI1). El objetivo del presente trabajo fue el establecimiento de cultivos de raíces transformadas de Stevia rebaudiana con el plásmido binario pCAMBIA1105.1 y diseño de una estrategia de ingeniería metabólica para la modificación de la ruta de biosíntesis de glucósidos de esteviol. Para ello, se realizó la inserción del vector pCAMBIA1105.1, en tres cepas de A. rhizogenes (AR4, K599 y LBA9402), las cuales se movilizaron en plántulas de S. rebaudiana para obtener cultivos de raíces. Paralelamente, se realizó un diseño in silico y la modificación del gen que codifica la IPI1, para posteriormente realizar análisis de modelado por homología de la secuencia modificada en el servidor I-TASSER. Se logró establecer cultivos de raíces transformadas control a partir de plántulas in vitro de S. rebaudiana con las cepas LBA9402, K599 y AR4 de A. rhizogenes, mostrando rasgos fenotípicos distintos a los cultivos no transformados. Sin embargo, se observó que la cepa LBA9402 mostró la mayor virulencia. El diseño in sílico del gen IPI1 mostró seis cambios puntuales codónicos de la secuencia, la cual fue sintetizada y modelada en el servidor I-TASSER generando una estructura tridimensional hipotética. Con los resultados obtenidos en este trabajo se establecen las bases metodológicas para continuar hacia la transformación de S. rebaudiana con el gen IPI1 modificado, como propuesta para explorar el aumento de la síntesis de glucósidos de esteviol mediante ingeniería metabólica.