Evaluación de un biofungicida basado en RNAs de doble cadena (dsRNAs) dirigidos contra genes de patogénesis de Penicillium digitatum para la protección de frutos de naranja (Citrus sinensis) en la etapa poscosecha

Abstract

La citricultura es una de las principales actividades agrícolas en México. Desafortunadamente, es vulnerable al ataque de hongos fitopatógenos que provocan grandes pérdidas, principalmente en la etapa poscosecha. Uno de los principales patógenos de cítricos es Penicillium digitatum que junto a Penicillium italicum puede llegar a causar hasta el 90% de las pérdidas totales en la producción. El desarrollo de una nueva generación de biofungicidas efectivos, amigables con el medio ambiente, y que no representen un peligro para la biodiversidad ni para la salud humana es uno de los retos más grandes de la biotecnología vegetal. Una tecnología novedosa llamada SIGS (silenciamiento génico inducido por aspersión), se basa la aplicación de RNAs exógenos de doble cadena (dsRNAs). Los dsRNAs pueden ser tomados y procesados por la planta, o bien, tomados directamente por el patógeno, y una vez dentro de sus células, efectúan un proceso de silenciamiento génico sobre genes blanco. En el presente trabajo se tuvo por objetivo diseñar un fungicida de dsRNAs y evaluar su efecto en el control de P. digitatum sobre frutos de naranja. Para esto se realizó una búsqueda en la literatura de genes que se inducen durante el proceso infectivo de P. digitatum, con la finalidad de identificar genes clave para la virulencia. A partir de dicho análisis se seleccionaron como blancos los genes, FET5 (transportador de hierro), Mic-33 (Proteína precursora de etileno), y NIP (Proteína inductora de necrosis), y se amplificaron mediante PCR regiones de estos genes que cumplieran con la condición de no tener similitud con el genoma de C. sinensis. Se amplificó un fragmento de 500 pb de FET5, y dos fragmentos de 250 pb de Mic-33 y NIP que posteriormente se fusionaron. Los fragmentos amplificados se adicionaron con la secuencia del promotor T7 en los extremos, se clonaron, se secuenciaron para su confirmación, y se emplearon como templados para la síntesis de dsRNA (RNAi) largos (ldsRNAs) y cortos (sdsRNAs). Los ldsRNAs de Mic-33/NIP y FET5 se mezclaron en cantidades equimolares y se aplicaron por aspersión sobre frutos de naranja en tres tiempos, y posteriormente con una suspensión de esporas de P. digitatum. Mediante el análisis del diámetro de las lesiones desarrolladas, se observó una inhibición estadísticamente significativa del desarrollo de la infección en las naranjas que fueron tratadas con ldsRNAs, pero sin diferencias estadísticas en términos de la incidencia de la infección ni en el desarrollo del hongo. Estos resultados abren nuevas direcciones para investigar a mayor detalle la escala temporal del efecto fungicida de los dsRNAs, así como estrategias alternativas para cuantificar el desarrollo de la infección, y con esto continuar explorando el potencial de uso de las formulaciones de dsRNAs para la protección de frutos de naranja en la etapa postcosecha.