Método de qPCR multiplex para el diagnóstico molecular de los virus de Zika, Dengue y Chikungunya

Abstract

El clima húmedo tropical de algunas regiones de México permite el desarrollo de Enfermedades de Transmisión Vectoriales (ETV). Las ETV con mayor prevalencia en el país son las que se transmite por el mosquito del género Aedes, este vector tiene la capacidad de transmitir tres arbovirus; chikungunya (CHIKV), dengue (DENV) y zika (ZIKV). Cada virus causa un cuadro febril muy parecido, pero dependiendo del virus causante de la enfermedad es el nivel de prioridad para su seguimiento, porque solo el virus de dengue puede causar daño severo e irreversible como la muerte, mientras que los virus de zika y chikungunya raramente producen cuadros febriles tan severos como el dengue, por este motivo sólo los pacientes con dengue se quedan internados en los centros de salud para su recuperación y seguimiento. Por lo tanto, para poder diagnosticar específicamente el agente causal se requieren de técnicas moleculares que permitan diferenciar el virus causante de la enfermedad. Las técnicas de diagnóstico para su identificación se clasifican en dos tipos: el diagnóstico clínico que se basa en la determinación del virus causante de la enfermedad con el cuadro clínico que presenta el paciente, y las pruebas de laboratorio que se realizan mediante el análisis de la muestra para determinar si está o estuvo presente el virus durante la enfermedad. Actualmente, los diagnósticos para estos virus se realizan de manera rutinaria debido al impacto social y económico que causa en los países del continente americano. Sin embargo, existen muy pocas técnicas de diagnóstico que permitan determinar los tres virus al mismo tiempo. Las que actualmente se utilizan en el mercado se basan en el uso de sondas Taqman, las cuales tienen un alto costo y un diseño complicado para su elaboración. Por tal motivo se hace necesario el diseño de una técnica de diagnóstico más económica y reproducible. Por tal motivo, en este trabajo se diseñó una prueba de diagnóstico alternativa que permita disminuir los costos en la detección molecular simultanea de estos tres virus utilizando la técnica qRT-PCR múltiple. Se realizó la qRT-PCR de un sólo paso usando al fluoróforo SYBR Green. Las muestras que se procesaron fueron de sangre humana recolectadas durante la fase aguda (1-5 días del inicio del cuadro clínico) y posteriormente, se realizó el análisis de las curvas de disociación para obtener el diagnóstico. Para poder confirmar que la técnica pueda ser usada como una técnica de diagnóstico molecular confiable, se evaluaron los parámetros de Especificidad, Reproducibilidad, Repetibilidad, Factibilidad y Sensibilidad para verificar que la técnica cumpla con los requisitos mínimos propuesto por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para poder ser utilizados como un diagnóstico y se determinó que la técnica cumple con los requisitos para ser utilizados como un kit de diagnóstico molecular para detectar los virus de chikungunya, dengue y zika de manera simultánea.